本文是学习GB-T 33834-2017 微束分析 扫描电子显微术 生物试样扫描电子显微镜分析方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了生物试样扫描电子显微镜分析的技术要求和规范。
本标准适用于各种类型的扫描电子显微镜。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 21636 微束分析 电子探针显微分析(EPMA) 术语
GB/T 23414 微束分析 扫描电子显微术 术语
GB/T 23414 和GB/T 21636
界定的术语和定义以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
电子枪 electron gun
电子显微镜中的电子光源，由一发射体(加热钨丝、六硼化镧 LaB。
灯丝、冷场或热场发射尖端)与
电子加速系统组成。
3.2
电子束 electron beam
由电子光学系统聚焦到试样表面的一束电子。
3.3
加速电压 accelerating voltage
为加速从电子源发射的电子而加到灯丝和阳极之间的电位差。
3.4
生物试样 biological specimens
供扫描电子显微镜分析用的具有或者曾具有生命形式的各种动物、植物和微生物样品。
3.5
二次电子 secondary electron
由于入射电子轰击试样而从试样表面发射的电子。
注：通常把能量小于50 eV 的电子称为二次电子。
3.6
背散射电子 backscattered electron
通过背散射过程从试样的电子入射表面出射的电子。
注：通常把能量大于50 eV 的电子称为背散射电子。
GB/T 33834—2017
3.7
图像分辨率 image resolution
能被清楚地分开、识别的两个图像特征之间的最小间距。
3.8
图像放大倍率 image magnification
扫描电镜显示的线性尺度L 与试样上扫描范围的相应长度l
之比则为图像放大倍率，以M 表示，
M=L/l。
3.9
工作距离 working distance
物镜极靴下表面与试样表面之间的距离。
3.10
像散 astigmatism
一个物点发出的电子，不是像理想柱状透镜聚焦成一点，而是聚焦形成2条互成90°的分离聚焦线。
注：像散是由于极靴加工精度、极靴材料不均匀、透镜内线圈不对称及不完善的光阑形成的透镜不对称磁场产生。
3.11
荷电 charging
由于缺少足够的对地导电途径，当试样受入射电子束轰击时其表面发生电荷积累的现象。
3.12
导电镀层 conductive coating
一种覆盖到绝缘试样表面的低电阻材料(如金、铂、铬、碳等)薄镀层，以提供电子束轰击时可能在表
面积累电荷的接地通道。
注：导电镀层一般厚度为2 nm～20 nm。
3.13
扫描电子显微镜 scanning electron microscope;SEM
通过电子束扫描试样表面产生放大图像的一种仪器。该仪器用细聚焦的高能电子束轰击试样表
面，通过电子与试样相互作用产生二次电子、背散射电子等信息，可对试样表面或断口形貌进行观察。
3.14
冷冻扫描电子显微镜 cryo-scanning electron
microscope;Cryo-SEM
样品台由液氮致冷的专用扫描电镜，以及在扫描电镜上附加液氮致冷的冷冻样品台附件，可将含
水、含油试样超低温快速冷冻至固体状态下进行观察。
由电子枪发射电子，经聚光镜和物镜的逐级会聚，形成具有一定能量和照明强度、束斑直径极细的
入射电子束(电子探针),在扫描线圈的作用下，电子束在试样表面作光栅状扫描，通过闪烁体等检测器
件接收试样中被激发出的二次电子、背散射电子等信号，把它转变成光信号，再经光电倍增管放大并转
变成电信号，最后由计算机进行信号数据处理，在显示器上呈现试样表面形貌的电子图像。
冷冻扫描电镜的成像原理同常规扫描电镜，区别在于样品台是由液氮致冷，并可以调节温度，控制
冰的升华，观察的是经过超低温冷冻固化的试样。
GB/T 33834—2017
5.1.1
扫描电镜由电子光学系统(电子枪、电磁透镜、光阑、扫描线圈、合轴线圈、消象散器、样品室)、信
号检测处理系统、真空系统、电气系统和计算机系统等组成。
5.1.2
冷冻扫描电镜除了扫描电镜所有的组件外，还包括冷冻样品台和外置的样品快速冷冻装置，主
要有：液氮泥装置、真空转移装置、准备室、扫描电镜样品室内的组件、控制板、电子箱和真空泵系统、氮
气和氩气装置、红外观察器等。
5.3.1 电源电压及频率稳定(220 V±22V,50 Hz±1 Hz)。
5.3.4 场发射扫描电镜要求杂散电磁场干扰应小于0.1 μT。
5.3.5 场发射扫描电镜的地基振动不超过5μm (峰-峰值)。
5.3.6 具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器的要求。
5.4.10 冷台粘样胶水。
5.4.11 液氮。
5.4.12 氮气(高纯)。
5.4.13 氩气(高纯)。
5.4.14 离子溅射金靶。
5.4.15 离子溅射铂靶。
GB/T 33834—2017
6.1.1
自然状态下化学和物理性能上稳定的固体生物样品如：动物毛发、骨头、牙齿、干燥的植物种子、
干标本等，在真空及在电子束轰击下不挥发、不变形、无放射性和腐蚀性，适合于扫描电镜在高、低真空
条件下观察分析。
6.1.2
自然状态的生物样品如：动物组织和细胞，植物的根、茎、叶、花，真菌、细菌等微生物样品，水生
生物，培养在各种固体材料上的生物细胞等，需要用化学或物理方法进行试样干燥和表面导电处理，然
后进行扫描电镜观察分析。或者不经过试样干燥处理，采用冷冻扫描电镜进行观察分析。
6.2.1 扫描电镜观察生物试样表面的制备方法
6.2.1.1 取材：将生物组织切成直径不大于10 mm,
高度为3 mm～5mm 的小块，采用与固定液配置相
同的缓冲液或生理盐水清洗试样表面，游离细胞或微小试样用缓冲液离心漂洗。
6.2.1.2 前固定：将清洗后的试样放入由0.1 mol/L
磷酸盐缓冲液(或其他缓冲液)(pH6.8～7.2) 配置
的2%～3%戊二醛固定液中进行前固定，植物组织前固定期间应经过抽气以排出组织内含的气体，使
固定液充分渗透进入试样，4℃下前固定2 h
以上。培养细胞和游离细胞固定的时间可以缩短至1 h。 固定液的配置参见附录
A。
6.2.1.3
后固定：经戊二醛固定的生物试样用与前固定相同的缓冲液充分漂洗后，加入相同缓冲液配置
的1%四氧化锇固定液，4℃下固定1 h～2 h。
6.2.1.4
脱水和置换：用浓度分别为50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇或丙酮进行梯度脱水，
每级浓度脱水5 min～15 min。
吸弃100%脱水剂，转入醋酸异戊酯与脱水剂1:1的混合液中置换
10 min～20 min,并适当摇动，再转入纯醋酸异戊酯中充分置换。
6.2.1.5
干燥：脱水后的生物试样可选用临界点干燥法或冷冻干燥法进行干燥。
临界点干燥：脱水后的生物试样采用临界点干燥法进行干燥，临界点干燥仪采用液态二氧化碳为介
质，具体步骤按照临界点干燥仪的操作说明进行。
冷冻干燥：脱水后的生物试样也可以采用冷冻干燥法进行干燥，经100%脱水剂脱水后，转入75%
的叔丁醇中过渡10 min,
再置于100%的叔丁醇中两次，然后在冷冻干燥仪上进行冷冻干燥，具体步骤
按照冷冻干燥仪的操作说明进行。
6.2.1.6
粘样：用导电双面胶带或导电银胶将试样粘接在扫描电镜样品台上，使试样观察面朝上。
6.2.1.7
表面导电处理：采用离子溅射法对干燥后的生物试样表面喷镀一层导电镀层，如金、铂或碳。
场发射扫描电镜高分辨观察的试样应用铂进行表面喷镀，具体步骤按照离子溅射仪的操作说明进行。
6.2.2 扫描电镜观察生物试样断面的制备方法(乙醇割断法)
6.2.2.1 将生物组织切成(1 mm～3mm左右的长条状，按照与表面观察相同的试
样制备方法进行化学固定和乙醇梯度脱水。
6.2.2.2
将试样连同100%乙醇包裹在空心胶囊中，封闭胶囊，不留气泡。
6.2.2.3
将此胶囊迅速投入液氮快速冷冻，用钳子夹持单面刀具插入液氮预冷，然后将刀刃对准胶囊想
要割断的部位，用榔头敲击刀背割断试样。
6.2.2.4
将冷冻割断的试样迅速投入室温下的乙醇中，融化后试样与胶囊脱离，再转入醋酸异戊酯中过
渡，进行临界点干燥；或者转入叔丁醇中过渡，进行冷冻干燥。
GB/T 33834—2017
6.2.2.5
将试样的割断面朝上粘到样品台上，然后采用离子溅射法在割断面上喷镀导电镀层。
调试扫描电镜使之达到规定的技术指标，保证仪器正常运行并能提供清晰、正确的图像。
7.2.1
开启扫描电镜，待真空度达到仪器规定的高真空指标后进行观察前的仪器检查，对中电子束，消
除图像像散。
7.2.2
关闭电子枪发射后对样品室放气，按要求将试样装入样品室，重新抽真空。对于场发射扫描电
镜则是切断电子束通道后进行样品室放气和安装试样，不关闭电子枪发射。对于设有换样预抽室的扫
描电镜则是通过该装置进行换样操作，无需对电镜样品室放气和重新抽真空。
7.2.3
根据不同生物试样的观察要求，设置扫描电镜观察条件。高分辨观察需要短工作距离，大视野
低倍率观察需要长工作距离，观察生物试样时工作距离一般选择在10 mm
左右，高分辨率观察可选择 在 3 mm～5mm。
样品台倾角根据试样情况进行调整，对于表面平坦的试样可选择30°~45°甚至更大
的倾角。对于导电性良好的试样，加速电压一般选用15 kV～20
kV,对于导电性差容易产生荷电的试 样可采用1 kV～3kV 甚至1 kV
以下的低电压。
7.2.4
打开电子枪束流，选择需要的信号检测器，获得二次电子扫描图像或背散射电子扫描图像。
7.2.5
根据观察需要选择合适的放大倍率，进行图像聚焦、消像散、亮度和反差调节等操作。
7.2.6 根据不同需要选择物镜可变光阑。
7.2.7 根据不同需要选择图像扫描模式和扫描速度。
7.2.8 对感兴趣区域的生物试样形态结构进行图像记录。
7.2.9
观察结束后，依次关闭扫描电镜的灯丝电流和加速电压，关闭主机电源和稳压器，油扩散泵真空
系统需要等待15 min
后再关闭冷却循环水。场发射扫描电镜观察结束后，关闭加速电压，退出计算机
系统，让仪器处于抽真空待机状态。
7.3
冷冻扫描电镜(或配置冷冻台附件的扫描电镜)的试样处理和观察分析步骤
7.3.1
试样：冷冻扫描电镜(或配置冷冻台附件的扫描电镜)观察用的含水生物试样不需经过任何处
理，保持试样原貌或仅做适当的表面清洁即可。
a) 开启扫描电镜，打开冷冻部分的电源开关，对准备室抽真空。
b) 待准备室达到要求的真空度后，加液氮降温，使准备室样品台温度降至-150
℃以下。
c) 在液氮泥装置里注入液氮，并抽真空，使液氮成为液氮泥。
d)
给扫描电镜样品室内的组件加液氮或者通入经过液氮冷却的干燥氮气，使其温度降至—
150℃ 以下。
e)
用冷台粘样胶水将固体试样粘于样品台上，液体试样可直接滴在样品台上，用真空转移装置把
粘有试样的样品台迅速插入液氮泥中充分冷冻。抽真空后，把试样拉入真空转移装置的腔内，
盖上盖，转移到准备室。如需要，在准备室内完成试样的冷冻断裂。
f) 设定升华温度进行试样的升华。
g)
升华结束后，使试样温度重新达到—150℃以下。打开氩气，按下镀膜键，进行表面镀膜。
h)
镀膜结束，待真空达到要求后，打开准备室与扫描电镜样品室之间的隔离阀，将试样从准备室
移入扫描电镜样品室内，然后退出真空转移装置，关闭隔离阀，进行扫描电镜观察，记录图像。
GB/T 33834—2017
在观察期间需保持扫描电镜样品室内组件温度在一150
℃以下，视需要可续加液氮。
i) 观察结束后，关闭扫描电镜电子枪发射，打开隔离阀，拉出试样。
j)
放出剩余液氮，给样品室内组件和准备室回温，待温度回到室温后，才可关闭冷冻部分的电源。
视需要选择关闭扫描电镜或者让其继续运行。
生物试样的扫描电镜形态观察结果以记录的电子图像形式提供，图像上应注明样品名称、标尺、放
大倍率等工作条件。在文字报告中应注明电镜型号、工作条件和制样方法。
如果图像显示器上出现横向条纹闪烁、图像结构断裂、图像衬度及亮度异常等现象，表明生物试样
导电性不佳，应该停止观察，取出试样后重新喷镀表面导电镀层。
如果图像显示器上显示试样变形或损伤严重，表明试样前处理不符合要求，应重新进行试样的前
处理。
9.3 冷冻扫描电镜的试样结霜、产生冰晶等
如果在冷冻扫描电镜观察时发现试样表面结霜，冷冻断裂样品时发现试样内部产生异常大的冰晶
结构，表明试样快速冷冻速率不够，或除霜处理不当，应重新进行试样快速冷冻，调整除霜参数，以得到
结构良好的图像。
分析结果报告应包括以下信息：
a) 分析报告的唯一编号；
b) 分析报告的页码；
c) 样品名称；
d) 送样人姓名、单位和地址；
e) 样品的接收日期；
f) 实验室名称和地址；
g) 分析检测依据；
h) 分析仪器及其工作条件；
i) 分析结果和必要的说明；
j) 分析报告负责人的签字；
k) 分析报告的日期。
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(资料性附录)
常用固定液的配方
A.1 戊 二 醛 固 定 液
A.1.1 0.2 mol/L 磷酸缓冲液
分别配制 A 液和 B 液，然后按照表 A.1 量取 A 液和B 液混合后测 pH 值。
A 液
B 液
NaH₂PO₄ ·H₂O
或 NaH₂PO₄ ·2H₂O
加双蒸馏水到1000
Na₂HPO₄ ·2H₂O
或 Na₂HPO₄ · 12H₂O
加双蒸馏水到1000
mL
mL
27.60
31.21
35.61
71.64
g
g
g
g
表 A.1 不同 pH 值磷酸缓冲液配制表
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A.1.2 0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液
分别取0.2 mol/L 磷酸缓冲液、25%戊二醛水溶液和双蒸馏水，按照表 A.2
量取混合。
表 A.2 戊二醛固定液配制表
| 0.2 mol/L磷酸缓冲液/mL |
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A.2 四氧化锇固定液
A.2.1 2% 四氧化锇贮存液
将装有四氧化锇的安瓿(共0.5
g)清洗干净，用玻璃划割器在上面刻痕，再用蒸馏水冲洗几次，放入
洁净棕色广口玻璃瓶内，加上25 mL
双蒸馏水，用洁净玻璃棒捣破安瓿。然后用石蜡将广口玻璃瓶严
密封口，贴上标签备用。将配好的2%四氧化锇贮存液置于干燥器中，4℃保存。
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A.2.2 0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的四氧化锇固定液
取等量的0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH
值7.2)与2%四氧化锇贮存液混合，现配现用。
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